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 免疫熒光技術(shù)操作步驟 

一.  直接免疫熒光法測抗原 

基本原理 

        將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對使用標(biāo)記抗體用量偏大。 

試劑與儀器 

          磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 

          熒光標(biāo)記的抗體溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進行稀釋 

          緩沖甘油：分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制 

          搪瓷桶三只（內(nèi)有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） 

          有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊） 

          熒光顯微鏡 

          玻片架 

          濾紙 

          37℃溫箱等。 

實驗步驟 

1.  滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。 

2.  滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其*覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一

30min  

定時間（參考：30min）。 

3.  取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗后，再按順序過 0.01mol/L，

pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時振蕩。 

4.  取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。 

5.  立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示： 

（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ 

--++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）

或（-），即可判定為陽性。

注意事項

1.  對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋在 1：20-100 之

間，要自行摸索*梯度，建立的稀釋比例，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，

影響結(jié)果的觀察。 

2.  染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時間可以從 10 min 到數(shù)

小時，一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于 37℃可加強染色效果，

但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用 0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染

色過夜較 37℃30 min 效果好的多。 

3.  為了保證熒光染色的正確性，試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染

色的干擾。 

（1）標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。 

（2）特異性對照（抑制試驗）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗

體。 

    如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，  待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。 

4.  一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過 3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。

二.    間接免疫熒光法測抗原 

基本原理 

染色程序分為兩步，*步，用已知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原（待檢標(biāo)本）

標(biāo)本上，在濕盒中 37℃保溫 30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。

第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗 IgG、IgM 抗體（通常為熒光標(biāo)記的對應(yīng)二抗）。

如果*步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的熒光標(biāo)記的二抗就會和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)

合，從而可鑒定被檢測抗原。 

試劑與儀器 

          磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 

          緩沖甘油：分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制。

          熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進行稀釋  。 

          搪瓷桶三只（內(nèi)有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） 

          有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊） 

          熒光顯微鏡 

          玻片架 

          濾紙 

          37℃溫箱等。 

實驗步驟 

1.  滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于未知抗原標(biāo)本片，10min 后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。 

2.  滴加以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 適當(dāng)稀釋抗體，覆蓋未知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫 30min。 

3.  取出玻片，置于玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗 1-2 次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 5min，不時振蕩  。 

4.  取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記二

抗 

5.  將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫 30min。 

6.  重復(fù)操作 3。 

7.  取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。

8.  熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。 

注意事項 

1.  熒光染色后一般在 1h 內(nèi)完成觀察，或于 4℃保存 4h，時間過長  ，會使熒光減弱。 

2.  每次試驗時  ，需設(shè)置以下兩種對照： 

（1） 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物   （需有使用人員自行建立標(biāo)準(zhǔn)） 

（2） 熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物 

如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，  待檢標(biāo)本呈強熒光，則為

特異性陽性染色。  

3.  未知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。 

4.  所滴加的抗體或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在未知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體

流失，從而造成非特異性熒光染色。 

Storage:  Store at –20 ºC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The 

lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater 

than a year when kept at -20ºC. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent 

of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 ºC. 

Important Note:  This product as supplied is intended for research use only, not for use in 

human, therapeutic or diagnostic applications.